激活了信号通路，该检测哪个蛋白才能证明确实激活了？

2024-11-12 03:39:14

激活了信号通路，该检测哪个蛋白才能证明确实激活了？

常用的几个信号通路，NFKB,TGF-beta,WNT,，假如我用激活剂激活了这些信号通路，那如何证明信号通路确实被激活了？除了报告载体以外，用western检测哪些关键蛋白，才能证明确实激活了？

（1）western主要检测信号系统中的蛋白磷酸化水平，如果磷酸化水平升高则说明蛋白激活了。（2）另外还有检测NF-kB和DNA的结合水平，主要采用EMSA，和报告基因的方法。（3）检测TNF,IL,iNOS,COX-2的mRNA表达（RT-PCR）。（4） 检测IkB的磷酸化，泛素化和降解（IP,Western）。（5）需要检测的蛋白主要包括：IKKa,IKKb,IkB-a,NF-kB,Akt,TAK1,TAB1,TAB2,NF-kB,COX-2,iNOS等。

如果你想研究机制，也就是你的外源性刺激是怎么激活某个通路的，我认为是从上到下做，配合好工具药物和各种干扰手段，如果就是想看个结果，也就是看哪个通路被激活了，那就测个下游信号吧。但是，你要知道，因为很下游，所以受到调控的因素会很多，而且信号被放大很多，同一个刺激完全可能会激活很多种下游信号。比如比较下游的ERK，Gi，Gq，Gs，TKR，都可以刺激MAPK，不管是直接的还是间接的。另外检测的时间非常重要，转录调控中有快反应的，有慢反应的。

关于Wnt信号通路我想再补充一下：1、Wnt信号通路有三条：经典的Wnt信号通路、PCP通路和Wnt钙离子通路。PCP通路的下游基因由c-Jun和JNK，可以检测他们的磷酸化水平。而Wnt钙离子通路的研究不是很清楚，主要跟细胞内Ca2+的释放有关。2、经典Wnt信号通路主要是通过beta-catenin与TCF蛋白家族成员（包括TCF1、LEF-1、TCF3和TCF4）形成转录激活复合物，激活包括cyclin D1在内的下游靶基因的转录。要检测该通路的激活可以检测Lef-1或TCF（如Top/Fop系统)荧光素酶报告系统的活性。另外还可检测游离beta-catenin的含量的变化；如果只检测蛋白水平变化的话，建议检测核内beta-catenin的变化，只有核内beta-catenin的水平才表示Wnt信号的激活与否（核内beta-catenin升高表示Wnt信号激活，反之，抑制）。另外也有检测beta-catenin磷酸的，但磷酸化beta-catenin被E3连接酶识别，然后被降解，所以若外界刺激激活了Wnt信号通路则磷酸化的beta-catenin的水平降低，而总的beta-catenin的水平应该是升高的。

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