植物乳杆菌KLDS1.0391 PurR和PurL蛋白的原核表达、纯化及其与细菌素合成启动子的相互作用

植物乳杆菌KLDS1.0391分离自内蒙古传统发酵乳制品，能代谢产生对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作用的细菌素，2% NaCl胁迫可促进其细菌素合成，转录组学分析表明，盐胁迫时purR基因和purL基因表达显著下调，推测其可能参与细菌素合成的调控作用。

purR基因编码的PurR蛋白是嘌呤从头生物合成途径中的阻遏蛋白，对嘌呤生物合成途径中11 个pur系列的结构基因具有转录调节作用。不同细菌中pur基因的分布和调控遵循不同的规则。关于植物乳杆菌purR的研究较少，但有研究表明乳酸乳球菌中的purR与枯草芽孢杆菌中的purR同源。PurR可能存在尚未被开发的功能。

purL基因也参与嘌呤生物合成途径，对于腺嘌呤和硫胺素的生物合成是必需的。植物乳杆菌KLDS1.0391全基因组测序以及BLAST分析发现，该菌包含4 个与细菌素合成相关的操纵子plnEFI、plnBD、plnGHSTUVW及plnXY，不同植物乳杆菌pln基因簇结构相似但不完全相同，但是所有的pln基因簇都具有非常相似的启动子，每个操纵子的启动子由2 个半保守的直接重复序列组成，通过全基因组测序结果可以比对获得植物乳杆菌KLDS1.0391中的plnE和plnG启动子。

本研究中，东北农业大学乳品科学教育部重点实验室的李欣芮、赵桉和孟祥晨*等人的主要目的是通过体外分子相互作用的方法探究PurR和PurL蛋白能否与植物乳杆菌KLDS1.0391启动子相结合，进而判断这两个蛋白是否直接参与细菌素合成的调控。

1 重组克隆载体及重组表达载体的构建与鉴定

针对构建的克隆载体pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL以及表达载体pQE-30-purR和pQE-30-purL，用相应的酶分别进行分步酶切鉴定，电泳结果显示有两条明亮条带（图1）。用pMD 19-T simple通用引物以及pQE-30测序引物进行测序，测序结果用BLAST工具与全基因组测序结果进行比对，序列完全一致，表明克隆载体pMD 19-T simple-purR和pMD 19-T simple-purL，以及表达载体pQE-30-purR和pQE-30-purL已成功构建。

2 PurR蛋白和PurL蛋白的诱导表达及鉴定

如图2所示，与未诱导的菌体蛋白相比（泳道1），加入IPTG诱导剂后的菌体蛋白（2～7泳道）在箭头处出现明显的蛋白条带，与软件预测大小相近，PurR蛋白和PurL蛋白诱导表达成功。并且随诱导时间的延长，重组蛋白的表达量增加，诱导6 h的PurR蛋白和PurL蛋白表达量较高，6 h后蛋白表达量增加不明显，所以确定PurR蛋白和PurL蛋白的诱导时间为6 h。

3 PurR蛋白和PurL蛋白的纯化与定量

20 mmol/L以及50 mmol/L咪唑洗脱液都不会洗脱目的蛋白，并可以洗脱少量杂蛋白（图3）。对于PurR蛋白，200 mmol/L咪唑洗脱液就可以得到较高浓度的目的蛋白（图3A）；对于PurL蛋白，咪唑浓度需达到300 mmol/L时才可得到较高浓度的蛋白（图3B），经此方法纯化的目的蛋白条带较单一，纯度较高。Bradford蛋白质量浓度测定试剂盒检测纯化后PurR蛋白质量浓度为0.74 mg/mL，PurL蛋白质量浓度为3.8 mg/mL，这是由于PurR蛋白是对破壁后的上清液进行纯化，但部分PurR蛋白以包涵体形式存在，纯化过程中会有部分损失，且在浓缩过程中浓度增加会有析出。

4 BLI实验结果

单浓度预实验结果表明，plnE启动子与PurR蛋白和PurL蛋白可能存在结合作用，plnG启动子与PurR蛋白可能存在结合作用，plnG启动子与PurL不存在结合作用。所以对3 组可能存在相互作用的启动子与表达蛋白进一步进行浓度梯度实验，根据预实验结果调整固化物PurR蛋白质量浓度为25 μg/mL，PurL蛋白质量浓度为160 μg/mL，分析物DNA浓度梯度为86.2、43.1、21.5、10.75、5.37 nmol/L。在association步骤以及dissociation步骤曲线平直，且DNA浓度不同时，结合与解离曲线基本重合，3 组浓度梯度实验均没有浓度依赖的结合解离过程（图4），没有观察到PurR和PurL蛋白与plnE启动子和plnG启动子的直接相互作用。

5 EMSA实验结果

EMSA检测PurR、PurL蛋白与plnE、plnG启动子的结合作用发现，与不加蛋白的对照组（泳道1）相比，无论何种蛋白质量浓度，DNA条带均没有出现滞后现象，没有出现蛋白与启动子片段结合的条带（图5）。结合BLI实验结果，发现通过原核表达得到的PurR和PurL蛋白在体外没有观察到与植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成调控区域的plnE和plnG启动子直接的相互作用。

结 论

体外成功构建重组蛋白PurR和PurL，EMSA实验以及BLI技术结果表明，2 个重组蛋白与植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成基因的启动子在菌体外无直接结合作用，在菌体内的情况以及2 种蛋白对细菌素合成的调控是否属于间接调控作用，需进一步研究。

本文《植物乳杆菌KLDS1.0391 PurR和PurL蛋白的原核表达、纯化及其与细菌素合成启动子的相互作用》来源于《食品科学》2021年42卷6期75-81页，作者：李欣芮，赵桉，范小飘，高文文，尚佳萃，赵鹏昊，赵乐，周雪，孟祥晨。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191219-230。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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