《食品科学》：花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定

花生过敏是最严重的食物过敏之一。过敏原分为主要食物过敏原和次要食物过敏原，花生过敏原Ara h 1被认为是花生的主要过敏原，也是花生蛋白的主要组成部分。过敏原在致敏过程中，其线性B细胞表位发挥了至关重要的作用，但目前对于Ara h 1线性细胞表位的鉴定仍停留在检测覆盖过敏原氨基酸全序列的肽段与过敏患者血清IgE的结合强度上，工作量巨大。较准确的方法是，获得Ara h 1特异性抗体，利用噬菌体展示技术筛选获得结合表位肽段，但目前Ara h 1特异性抗体较难获得。另外，过敏原在经口摄入后，要经过胃和肠道的消化才会被小肠吸收。因此，过敏原或其主要线性B细胞表位必须具有抵抗胃肠道消化酶的性质，在经过胃肠道后能保留其相对完整或具有免疫活性能力结构。

据此，中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品质量与安全北京实验室的王俊娟、李欣芮、车会莲*等人先采用生物信息学分析花生主要过敏原Cupin超家族Ara h 1线性B细胞表位的氨基酸组成，及其与Ara h 1二级、三级结构之间关系，总结归纳线性表位存在的规律。从天然花生中提取粗蛋白，经体外模拟胃肠道消化后，利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术检测过敏原Ara h 1保留的抗消化肽段。通过比较测定得到的抗消化肽段与预测得到的线性B细胞表位序列片段来预测更精确的Ara h 1线性B细胞表位。本研究建立的体外模拟胃肠道消化结合生物信息学鉴定Cupin超家族过敏原线性B细胞表位的方法可为低致敏性蛋白的制备提供参考。

1、花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的氨基酸组成特性

在致敏蛋白结构数据库中获取花生主要过敏原Ara h 1的23 个线性B细胞表位序列，具体如表1所示。使用Bioedit软件分析各种氨基酸在23 个Ara h 1 线性B细胞抗原表位中的分布，结果如图1所示，Ara h 1的线性B细胞表位由19 种氨基酸组成，构成全序列的甲硫氨酸（Met，M）没有出现。天冬氨酸（Asp，A）、谷氨酸（Glu，E）、甘氨酸（Gly，G）、脯氨酸（Pro，P）和精氨酸（Arg，R）的出现频率较高；亲水性氨基酸和带电氨基酸（如Glu、Arg等）在Ara h 1线性B表位出现频率较高。

2、花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位二级结构分析结果

从图2可以看出，Ara h 1线性B细胞表位的二级结构主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成，具有一定的回转折叠构象，全长包含418 个氨基酸，对应于Ara h 1中氨基酸序列的170～587位，涵盖了10～22号线性B细胞表位。大多数线性B细胞表位各二级结构并没有明显的分布规律，且不同表位的二级结构相差较大，还需对其高级结构进行进一步分析。

3、花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的高级结构

使用Cn3D软件将Ara h 1的10～22号线性B细胞表位标注于Ara h 1的空间结构上，即图3中深棕色单体的黄色区域。可以看到，大部分线性B细胞表位都位于单体之间的疏水相互作用结合区域，其结果也与线性B细胞表位的氨基酸组成分析结果一致性，即亲水性氨基酸在Ara h 1线性B表位中的出现频率较高。此外，有一部分线性B细胞表位埋入了Ara h 1三聚体的构象内部，不易被蛋白酶作用；另外，由于空间位阴效应，Ara h 1三级结构表现出B细胞表位被屏蔽，相比于那些露出甚至位于Ara h 1表面的表位，这些被屏蔽的表位可能需要经过变性后暴露出来才能发挥IgE结合活性。

4、花生主要过敏原Ara h 1抗消化片段

如图4所示，花生粗蛋白提取液在63 kDa处左右出现一条明显条带，其对应的是Ara h1。经不含胃蛋白酶的SGF和不含胰酶的SIF消化60 min后，其蛋白质条带未发生明显变化，说明提取的总花生粗蛋白在不含胃蛋白酶和胰酶的条件下具有热稳定性。经SGF、SIF消化30 s时，花生蛋白条带分布出现明显变化，大分子质量的条带变浅甚至消失，说明原样中的蛋白都被消化成小分子片段。在经SGF消化的整个过程中一直存在一条分子质量低于15 kDa的条带，在经SIF消化的整个过程中一直存在一条分子质量为10 kDa左右的抗消化片段。以上结果表明，花生提取物中的Ara h 1容易被胃蛋白酶和胰酶降解，但仍保留小分子片段，可能具有致敏活性。

5、抗消化肽段及预测表位在Arah1氨基酸序列的定位

如图5所示，在Ara h 1氨基酸序列的94～104、299～313、330～337、401～426、505～510、532～543、560～572以及574～582位置的抗消化多肽均与预测的线性表位存在部分氨基酸序列的交叉，证明了部分表位的抗消化性。经SGF消化后可以获取比SIF消化更多的肽段信息，可能有助于鉴定更多的线性B细胞表位。

结 论

Ara h 1的线性B细胞表位富含亲水性氨基酸如精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）以及天冬氨酸（Asp）等；分析其二级结构，Ara h 1线性B细胞表位的二级结构主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成，具有一定的回转折叠构象；对其三级结构进行分析发现，表位主要位于单体之间的疏水相互作用区域，部分表位埋入三聚体构象内部。其抗消化序列与表位之间存在部分重叠。综上，质谱检测体外模拟胃肠道消化肽段，并结合表位生物信息学分析，可以作为鉴定线性B细胞表位的新方法，并可为鉴定Cupin超家族过敏原线性B细胞表位和低过敏性蛋白的制备提供参考。

本文《花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定》来源于《食品科学》2021年42卷17期106-112页，作者：王俊娟，李欣芮，陈成，孙善峰，刘桂蓉，车会莲。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200701-008。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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