裂壶藻粉对奶山羊泌乳性能及乳腺上皮细胞转录调控机理研究

裂壶藻粉对奶山羊泌乳性能及乳腺上皮细胞转录调控机理研究

【摘要】： 本试验旨在研究日粮添加富含二十二碳六烯酸(DHA)的裂壶藻粉对奶山羊泌乳性能及乳品质的影响,并研究DHA对奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs)的转录组调控机理。为DHA在奶山羊的生产应用提供参考及理论依据。 试验选取48头胎次、体重、体况、泌乳阶段一致的健康奶山羊作为试验用羊,采用单因素完全随机试验方法将奶山羊分为4组:对照组,试验Ⅰ组,试验Ⅱ组,试验Ⅲ组,每组12只。每组均饲喂常规基础日粮,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组日粮中分别添加15g/(头·d)、20g/(头·d)、25g/(头·d)裂壶藻粉。试验预饲期7d,试验期56d,试验过程中奶山羊的泌乳性能及乳品质进行记录及测定。并构建奶山羊乳腺上皮细胞系,对细胞形态及功能进行研究,利用转录组测序技术探究DHA对奶山羊乳腺上皮细胞的调控机理。获得如下结果: 试验一富含DHA的裂壶藻粉对奶山羊泌乳性能及乳品质的影响 (1)各组奶山羊初始DMI处于同一水平(P>0.05),试验期56天内,奶山羊DMI与初始水平差异不显著,且各组间差异不显著(P>0.05)。 (2)与试验初期相比,试验末期各试验组产奶量均有一定程度的下降,但无显著差异(P>0.05)。 (3)各组乳脂率在试验结束时均有一定程度的降低。14d时,对照组、试验Ⅰ组均与试验Ⅲ组差异显著(P<0.05);试验第28d、35d、42d、49d、56d时,对照组与试验Ⅱ组、试验Ⅲ组差异显著(P<0.05),试验Ⅰ组与试验Ⅲ组差异显著(P<0.05)。 (4)对照组奶山羊乳中DHA含量一直处于较低水平,添加DHA组增长率与DHA添加量呈正向相关。7d时,试验Ⅰ组与试验Ⅱ组差异显著(P<0.05),其他各组间差异极显著(P<0.01);14d时,试验Ⅱ组与试验Ⅲ组差异显著(P<0.05),其他各组差异极显著(P<0.01);试验第21d、28d、35d、42d、49d、56d时,对照组与各试验组间差异均极显著(P<0.01),各试验组间差异极显著(P<0.01)。 试验二DHA对奶山羊乳腺上皮细胞增殖及细胞毒性的影响 (1)用i Cell原代上皮细胞基础培养基配制3.125、6.25、12.5、25、50、100μM/L浓度DHA,分析不同浓度DHA对GMECs细胞作用。结果表明:25μM/L DHA作用24h条件下,细胞增殖较其他各浓度效果最好;DHA作用48h显著抑制GMECs增殖;DHA浓度高于50μM/L时,GMECs增殖受到明显抑制。 (2)与对照组相比,3.125、6.25、12.5、25μM/L的LDH释放率无显著变化,说明在该浓度条件下对细胞的毒副作用较小;DHA浓度高于50μM/L时,细胞LDH显著增大,此时细胞毒性较强,不利于细胞后续试验的进行。 试验三DHA对奶山羊乳腺上皮细胞转录组测序分析 (1)通过绝对定量转录组测序技术构建了DHA在GMECs中表达的RNA文库,获得的Q20、Q30碱基序列占比均在96%以上,GC含量占比为53%左右,各个处理组的比对效率介于98.18%～98.43%,表明获得的转录组信息具有较高质量。 (2)从差异倍数和显著水平方面对差异基因进行筛选,以|log FC|>1且P-value<0.05作为筛选DEGs标准,共筛选出236个显著DEGs,其中108个基因表达上调,128个基因表达下调,其中有11个基因表达与脂肪代谢有关,主要为APOA1、CCDC3、FABP5、FOXO6、FADS3、FGF21、FOSL1、HMOX1、HSD17B11、KLF11、PDK4基因。 (3)通过GO富集分析发现,DEGs主要富集在铁结合(ferric iron binding)、铁离子结合(iron ion binding)、高分子细胞骨架纤维(polymeric cytoskeletal fiber)、中间纤维细胞骨架(intermediate filament cytoskeleton)、中间丝状体(intermediate filament)中,并通过以特定的方式参与Rho GT Pases、m TOR和Hippo等信号通路的信号转导,对细胞脂质代谢、肿瘤生成存在影响。 (4)通过KEGG富集分析后发现,DEGs显著富集到视黄醇的新陈代谢(Retinol metabolism)、谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)、亚油酸的新陈代谢(Linoleic acid metabolism)、化学致癌作用(Chemical carcinogenesis)、药物代谢-细胞色素P450(Drug metabolism-cytochrome P450)、PPAR信号通路中,其中亚油酸的新陈代谢(Linoleic acid metabolism)、PPAR信号通路中能够在脂代谢方面发挥重要作用。 (5)对随机选取的10个DEGs进行qRT-PCR验证,结果与RNA-seq结果高度一致,验证了测序结果的可靠性。 综上所述,DHA能显著提高奶山羊乳中DHA含量,为生产富含DHA产品提供有效方案,可作为一种有效添加剂应用到生产中。通过对获得的高质量测序数据分析后,在GO和KEGG通路中,可以看出DHA对奶山羊乳腺上皮细胞免疫和细胞骨架的构建具有显著的作用,并在GMECs相关抗炎、抗癌、代谢等相关通路中具有显著作用,并对脂肪代谢有一定的影响。

【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2022

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